SELAMAT DATANG DI X3-PRIMA, MELAYANI SETULUS HATI, MEMBERIKAN YANG TERBAIK

14.8.09

Kanker

PENGANTAR

Di banyak negara, kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian. Kanker disebabkan oleh berbagai penyebab, tetapi yang terpenting ialah pola hidup tertentu, misalnya merokok, minum minuman keras, atau mengunyah sirih. Namun zat kimia yang terdapat di lingkungan masyarakat dan beberapa obat juga berpe¬ran. Karenanya untuk mengurangi insidens kanker, pola hidup yang berbahaya ini perlu diubah; selain itu, berbagai karsinogen kimia perlu diidentifikasi agar pajanannya pada manusia dapat di¬hilangkan atau ditekan serendah mungkin. Zat kimia yang pasti dan yang mungkin merupakan karsinogen bagi manusia dicantum¬kan dalam Apendiks 7-1 (IARC, 1987).
Jenis riset lain dilakukan dalam penelitian karsinogenesis un¬tuk memperbaiki berbagai metode yang ada dan merancang meto¬de baru untuk identifikasi zat kimia karsinogen secara cepat dan handal. Metode yang kini tersedia terlalu mahal, makan waktu, atau tidak cukup handal. Masalah ini muncul terutama dari fakta bahwa kanker hanya terjadi sebagai respons terhadap suatu zat kimia lama setelah masuknya ke dalam tubuh. Sering kali zat ki¬mia itu tidak lagi dapat dideteksi di dalam tubuh pada saat tumor itu berkembang.
Di samping itu, bahaya karsinogen bagi kesehatan pun ber¬beda-beda, bergantung bukan saja pada potensinya, cara kerja, atau bobot (luasnya) bukti. Karenanya dalam bab ini digambarkan berbagai kategori karsinogen berdasarkan bobot bukti dan cara kerjanya; aspek potensinya dibahas dalam Bab 22.
Meskipun data manusia penting untuk menentukan apakah zat tertentu bersifat karsinogenik untuk manusia, data pada hewan sering diperlukan untuk mendukung data pendahuluan pada manu¬sia atau untuk memberi arah bagi penelitian selanjutnya pada ma¬nusia. Dalam banyak hal kelompok populasi khusus itu terpa¬jan pada berbagai zat lain yang mungkin suatu karsinogen. Da¬lam bab ini dibahas berbagai jenis informasi yang dibutuhkan dan masalah uji hewan.

Definisi
Istilah karsinogenesis kimia biasanya didefinisikan sebagai induk¬si atau peningkatan neoplasia oleh zat-zat kinua. Meskipun se¬cara etimologi arti tepatnya adalah induksi karsinoma, istilah ini digunakan secara luas untuk pembentukan tumor. Dengan kata lain istilah ini mencakup tidak hanya keganasan epitelial (karsi¬noma) tetapi juga tumor ganas mesenkim (sarkoma) dan tumor¬-tumor jinak. Tumor jinak dimasukkan di sini karena tidak ada karsinogen yang hanya menimbulkan tumor jinak.
Secara umum telah disetujui (misalnya WHO, 1969) bahwa respons suatu organisme terhadap suatu karsinogen dapat berupa satu atau beberapa reaksi berikut ini.
1. Meningkatnya frekuensi satu atau beberapa jenis tumor yang juga muncul dalam kelompok pembanding
2. Perkembangan tumor-yang tidak tampak dalam kelompok pembanding
3. Munculnya tumor lebih awal daripada kelompok pemban¬ding
4. Lebih tingginya jumlah tumor pada masing-masing hewan uji dibanding dengan hewan pembanding

Bukti dan Klasifikasi
Bukti karsinogenisitas didasarkan atas data pada manusia dan hewan. Meskipun demikian, karena perbedaan antarspesies dalam respons terhadap berbagai zat kimia, data yang diperoleh dari manusia sehat bobotnya lebih besar. Selain itu, bobot bukti itu akan meningkat bila tumor itu lebih ganas (bersifat invasif, me¬tastatik), bila ada penemuan positif dalam berbagai penelitian lan¬jutan dan dalam penelitian pada strain dan spesies hewan lainnya, bila muncul karsinogenisitas pada dosis yang sangat rendah, dan bila ada genotoksisitas. Dengan prinsip ini, berdasarkan karsino¬genisitasnya, zat kimia biasanya dikelompokkan seperti di bawah ini (EPA, 1986). IARC (1987) hanya mencantumkan empat kate¬gori pertama karena zat dalam kelompok terakhir tidak tercakup dalam penilaian mereka.
• Kelompok A-Karsinogen manusia: Bukti cukup pada manusia.
• Kelompok B-Sangat mungkin karsinogen pada manusia: Bukti terbatas pada manusia (B) atau tak ada bukti pada manusia te¬tapi cukup bukti pada hewan (B2).
• Kelompok C-Kemungkinan karsinogen bagi manusia: Bukti terbatas pada hewan dan tidak ada data pada manusia.
• Kelompok D-Tidak dapat digolongkan sebagai karsinogen bagi manusia: tidak cukup data atau tidak ada data
• Kelompok E-Terbukti bukan karsinogen bagi manusia: Buk¬ti negatif pada sekurang-kurangnya dua spesies.

Bukti pada manusia biasanya berasal dari latar belakang pe¬kerjaan. Misalnya 4-aminobifenil diketahui dapat menimbulkan kanker kandung kemih di kalangan beberapa pekerja. Penemuan ini dipastikan pada mencit, kelinci, dan anjing. Mirip dengan itu, asbes menginduksi tumor pada paru-paru dan rongga pleura, dan tumor-tumor ini juga muncul pada beberapa spesies hewan.
Di samping itu, beberapa obat terbukti dapat menimbulkan kanker pada manusia. Misalnya, siklofosfamid menginduksi kanker kandung kemih pada pasien-pasien yang menggunakannya, dan DES (dietilstilbestrol), yang bila diberikan pada wanita hamil dalam ¬dosis yang sangat besar, mengakibatkan tumor vagina dan uterus pada keturunan mereka. Ada bukti bahwa aflatoksin dan senyawa arsenik dari lingkungan telah meningkatkan insidens kanker hati dan kulit. Karsinogenisitas aflatoksin telah dipastikan pertama kali pada hewan, tetapi karsinogenisitas senyawa arsenik belum dipas¬tikan pada penelitian hewan.

Cara Kerja
Karsinogenesis kimiawi, seperti diperlihatkan pada Gmb. 7-1, merupakan proses bertahap, Zat karsinogen bekerja memicu peru¬bahan genetik tertentu dalam suatu set sehingga menyebabkan pembentukan neoplasma atau mengubah neoplasma menjadi kanker.
Zat genotoksik (biasanya terbentuk setelah bioaktivasi) berin¬teraksi dengan makromolekul genetik (DNA) untuk membentuk suatu carcinogen adduct (bagian DNA yang abnormal karena kar¬sinogen) menginduksi perubahan kimiawi lainnya pada DNA. Set yang bersangkutan mungkin akan mati atau berubah menjadi sel normal kembali setelah suatu mekanisme perbaikan DNA yang sempurna. Bila keduanya tidak terjadi, inisiasi karsinogenik men¬jadi : reversibel setelah set mengalami replikasi. Proses ini juga dapat mengikutsertakan konversi proto-onkogen menjadi onkogen aktif (Paul, dalam Iverson, 1988). Karsinogen kimiawi tertentu dapat mengaktifkan onkogen sehingga mengubah set normal men¬jadi sel kanker; onkogen juga dapat terbawa ke dalam set oleh retrovirus (Bishop, 1985). Gen-gen ini tampaknya berperan vital dalam berbagai tahap karsinogenesis. Set tumor yang telah meng¬alami inisiasi, dengan fenotipe dan genotipe yang telah berubah, mungkin tetap tenang untuk jangka waktu yang lama sebelum berubah menjadi tumor akibat proliferasi set oleh adanya zat-zat promotor. Keadaan tenang ini mungkin disebabkan oleh penga¬zuh hambatan dari sel-set normal di sekelilingnya melalui suatu komunikasi antarsel (Trosko dan Chang, 1988). Pengaruh ini da¬pat dikurangi dengan pembunuhan sel (misalnya dengan zat ki¬mia sitotoksik), pembuangan set (misalnya dengan hepatektomi parsial), faktor pertumbuhan (misalnya hormon), dan faktor-fak¬tor lain.



Gambar Diagram skematik nasib karsinogen gonotosil dan hubungannya dengan karsinogenesis. Peristiwa dijalur kiri menyebabkan pembentukan kanker, sementara yang dijalur kanan tidak. Tanda bintang menunjukkan langkah yang mungkin penting dalam tahap lain karsinogenesis.

Inisiasi umumnya dipandang sebagai proses permanen, sedangkan promosi tidak. Selain itu, proses promosi ini sifatnya berpulih. Maka, agar set yang telah mengalami inisiasi dapat te¬rus berkembang biak, ia harus terus menerus terpajan pada suatu promotor.
Konversi dan progresi ditandai dengan perubahan biokimia dan/atau morfologik dalam aktivitas dan struktur genom. Meka¬nisme terjadinya belum diketahui secara tepat, tetapi mungkin le¬wat pengaktifan sel yang sudah terinisiasi oleh pajanan zat-zat klastogenik atau karsinogen lengkap (Pitot dkk., 1988). Hampir sama dengan inisiasi, progresi merupakan proses yang tidak ber¬pulih.
Tabel 7-1 mencantumkan daftar sifat inisiasi, promcisi, dan progresi.
Untuk inforfnasi dan referensi lebih lanjut, lihat Williams dan Weisburger (1986) dan Iverson (1988).

KLASFIKASI KARSINOGEN
Menurut cara kerjanya, karsinogen dapat juga dikelompokkan menjadi karsinogen genotoksik dan epigenetik (non-genotoksik) (ICPEMC, 1982).

Karsinogen Genoteaksik
Karsinogen genotoksik menginisiasi tumor dengan cara menim¬bulkan kerusakan DNA (Gmb. 7-1). Ada dua jenis karsinogen ke¬lompok ini.
Karsinogen kerja langsung (juga dikenal sebagai karsinogen akhir) bersifat elektrofilik dan dapat terikat pada DNA dan mak¬romolekul lainnya. Contohnya adalah epoksid alkil dan aril, lakton, ester sulfat, nitrosamid, nitrosourea, dan kelat platinum amin. Ka¬rena zat-zat ini sangat reaktif, karsinogen kerja langsung ini sering lebih aktif in vitro ketimbang in vivo.


Tabel Sifat Morfologik dan biologik pada Tahap Inislasi, Promosi, dan Progresi Hepatokarsinogenesis pada tikus

Inisiasi Promosi Progresi
Ireversibel dengan potensi stem cell konstan. Stem cell yang mengalami inisiasi tidak dapat ditentukan secara morfologik Reversibel Ireversibel
Peka terhadap xenobiotik dan factor kimiawi lainnya Populasi sel yang mengalami promosi bergantung pada kontak yang terus-menerus dengan zat pemacunya Perubahan yang dapat diukur dan/atau dapat dikenal secara morfologik pada struktur sel genom
Banyaknya sel yang terinisiasi dapat dihitung Efisiensi dipengaruhi oleh factor diet dan hormonal
Membutuhkan pembelahan sel untuk “fiksasi” Pertumbuhan sel yang telah berubah peka terhadap factor lingkungan selama fase awal
Respons terhadap dosis tidak menunjukkan ambang yang dapat diukur Respon terhadap dosis menunjukkan ambang yang dapat diukur dan efek maksimal bergantung pada dosis zat pemacu Neoplasma jinak dan/atau ganas umunya dapat ditemukan
Efek relatif dari inisiator bergantung pada jumlah lesi fokal setelah jangka waktu promosi tertentu Keefektifan relative promoter bergantung pada waktu dan dosis untuk mencapai efek maksimal dan laju dosis Zat progresor bekerja memacu sel-sel yang sudah mengalami promosi untuk masuk ke tahap ini, tetapi mungkin bukan merupakan zat penginisiasi.
Sumber : Pitot, Beer, dan Hendrich, 1988

Prakarsinogen (juga dikenal sebagai prokarsinogen) memer¬lukan pengubahan lewat bioaktivasi untuk menjadi karsinogen akhir, baik secara langsung atau melatui pembentukan karsinogen antara (proximate carcinogens). Sebagian besar karsinogen kimia yang dikenal kini tergolong kelompok ini, misalnya: hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH), amin aromatik, hidrokarbon berhalogen, ni¬trosamin, sikasin, aflatoksin B, alkaloid pirolisidin, safrol, dan tioamid. Berbagai macam bioaktivasi terlibat dalam konversinya menjadi karsinogen langsung, seperti dibahas dalam Bab 3. Zat-¬zat ini mungkin juga menyebabkan penguatan onkogen.
Dikenal juga inisiator murni, misalnya trans-4-asetil-atninos¬tilben, yang dapat mengubah sel normal tetapi tidak dapat menghasilkan tumor tanpa adanya promotor. Karsinogen genotoksik yang lengkap, misalnya 2-AAF, bekerja sebagai inisiator selain sebagai promotor (Neumann, 1983).

Karsinogen Epigenetik
Zat-zat ini tidak merusak DNA tetapi meningkatkan pertumbuh¬an tumor yang terinduksi oleh karsinogen genotoksik. Cara ker¬janya macam-macam.
Kokarsinogen meningkatkan efek karsinogen genotoksik bila diberikan bersamaan. Kerjanya mungkin dengan meningkatkan ka¬dar inisiator, kadar karsinogen genotoksik itu sendiri, atau meta¬bolik reaktifnya. Ini dapat dicapai dengan meningkatkan absorpsi karsinogen di saluran cerna atau kulit, atau dengan meningkat¬kan bioaktivasi. Efek itu juga dapat dicapai dengan mengurangi eliminasi inisiator baik dengan menghambat enzim detoksifikasi atau dengan menghabiskan substrat endogen yang terlibat dalam reaksi fase II, misalnya glutation. Kokarsinogen lain seperti feri oksida dan asbes mungkin mempermudah sel menangkap karsi¬nogen genotoksik.
Selain meningkatkan kadar zat reaktif di tempat kerja, ko¬karsinogen dapat menghambat laju atau kejituan mekanisme per¬baikan DNA, atau meningkatkan konversi lesi DNA menjadi ke¬lainan permanen (VJilliams, 1984).
Promotor meningkatkan efek inisiator bila diberikan sesu¬dahnya. Contoh klasik bagi fenomena ini adalah penelitian de¬ngan PAH karsinogenik yang tidak menimbulkan kanker k-ulit pada kontak pertama dengan kulit. Bila di tempat yang sama se¬belumnya diberikan ester forbol dari minyak kroton, maka mun¬cullah kanker tersebut (Berenblum dan Shubik, 1947, 1949). Pe¬ngaruh promotor ini dapat bertahan selama berbulan-bulan atau bahkan setahun tanpa kehilangan efeknya. Penelitian ini dengan jelas menunjukkan adanya proses dua-tahap dalam karsinogenesis sekaligus menunjukkan persistennya efek inisiator. Secara kebetulan minyak kroton juga bersifat kokarsinogen karena bahan ini efektif pada pajanan bersama dengan inisiator.
Kemungkinan mekanisme kerja promotor antara lain (1) me¬rangsang proliferasi sel lewat sitotoksisitas atau efek hormonal; (2) menghambat komunikasi antarsel sehingga membebaskan sel yang sudah terinisiasi dari hambatan oleh sel-sel normal di se¬kitarnya; dan (3) imunosupresi.
Sitotoksikan misalnya asam nitrilotriasetat (NTA) menghasil¬kan tumor melalui proliferasi sel akibat kerusakan dan kematian sel (Anderson dkk., 1985).
Hormon misalnya, estradiol dan dietilstilbestrol telah terbukti dapat meningkatkan tumor pada hewan (misalnya kanker payudara pada mencit) dan pada manusia (misalnya kanker endometrium pada wanita menopause yang diberi estrogen). Zat-zat ini tidak bersifat genotoksik tetapi berlaku sebagai promotor. Inisiator yang sebenarnya tidak diketahui. Kalaupun ada, androgen hanya mempu¬nyai sedikit efek karsinogenik. Herbisid aminotriazol dan fungisid tertentu menginduksi tumor tiroid juga melalui mekanisme hormo¬nal (hlm. 335).
Komunikasi antarsel lewat gap junction merupakan meka¬nisme penting dalam pengaturan pertumbuhan sel. Sejumlah zat kimia mempengaruhi mekanisme ini sehingga menginduksi hiper¬plasia dan bertindak sebagai promotor dalam karsinogenesis (Tros¬ko dan Chang, 1988).
Berbagai obat imunosupresif makin lama makin sering di¬gunakan dalam transplantasi organ tubuh. Obat itu diketahui da¬pat menyebabkan leukemia dan sarkoma pada beberapa pasien, juga pada mencit dan tikus. Penyebab genotoksik mungkin be¬rupa virus, dan obat imunosupresif mendorong perkembangan tu¬mor lewat mekanisme epigenetik.
Karsinogen benda-asing contohnya adalah asbes dan bahan yang dicangkokkan, misalnya plastik, logam, dan gelas. Bahan-ba¬han ini tidak menunjukkan genotoksisitas, dan tumor yang diha¬silkannya adalah tumor mesenkim. Meskipun cara kerjanya tidak diketahui secara tepat, tumor yang ditimbulkannya didahului de¬ngan reaksi hebat terhadap benda asing misalnya berupa fibrosis hiperplastik dengan banyak penibahan kromosom dalam sel pra neoplastik (Rachko dan Brand, 1983).
Lain-lain
Sejumlah logam dan metaloid (misalnya: arsen, kromium, dan nikel) beserta senyawanya bersifat karsinogenik pada hewan; be¬berapa di antaranya diperkirakan bersifat karsinogenik juga pada manusia (IARC, 1987). Arsen dianggap sebagai suatu kekecua¬iian dalam arti bahwa zat ini bersifat karsinogenik pada manusia tetapi tidak pada hewan. Meskipun demikian data akhir-akhir ini menunjukkan bahwa penetesan As2O3 secara intratrakeal pada marmot Syria mengakibatkan meningkatnya adenoma paru-paru, dan setelah pajanan intrauterus, zat ini menyebabkan tumor paru¬-paru pada mencit.
Mekanisme karsinogenesis logam belum diketahui sepenuh¬nya, tetapi mungkin mengikutsertakan aktivitas genotoksik dan/atau epigenetik. Sunderman (1984) telah mengemukakan hal-hal berikut sebagai arah penelitian yang paling memberi harapan: ka¬tion logam (1) terikat secara kovalen pada DNA, (2) membentuk hubungan silang (cross-links) antara DNA dan protein atau an¬tara beberapa untaian DNA yang berdekatan, (3) merusak keji¬tuan replikasi DNA dengan mengubah struktur enzim polimerase DNA, (4) menyebabkan transisi helikal dari B-DNA ke Z-DNA, mempengaruhi struktur kramatin, dan (5) terikat pada histon, pro¬tein inti nonhiston, atau RNA nukleous, dengan demikian mem¬pengaruhi stnlktur kromatin dan ekspresi gen. Bahan-bahan ini dapat diklasifikasikan sebagai karsinogen genotoksik karena mem¬pengaruhi ekspresi gen melalui berbagai cara.
Proliferotor Peroksisom Berbagai zat kimia mempunyai si¬fat yang sama dalam menginduksi tumor hati pada hewan pe¬ngerat dan meningkatkan peroksisom dalam sel-sel hati. Karena¬nya zat-zat kimia ini dianggap merupakan kelompok karsinogen khusus (Reddy dan Lalwani, 1983). Contohnya, hipolipidemik misalnya klofibrat dan fenofibrat, plasticizer ftalat tertentu mi¬salnya di(2-etilheksil) ftalat, dan pelarut 1,1,2-trikloroetilen. Zat-¬zat ini tidak bersifat genotoksik, tetapi dengan meningkatkan jumlah peroksisom, mereka meningkatkan pembentukan H2O2 yang menyebabkan pembentukan berbagai oksigen reaktif, dan dengan demikian merusak DNA (Williams dan Weisburger, 1986).
Istilah karsinogen sekunder digunakan untuk zat-zat yang ti¬dak langsung bersifat karsinogenik tetapi dapat menginduksi kan¬ker setelah terjadinya efek lain yang nonkarsinogenik. Contohnya, polioksietilen monostearat (Myrj 45), pada dosis sangat tinggi, menyebabkan batu kandung kencing yang kemudian menyebab¬kan tumor kandung kemih. Tidak ditemukan tumor pada hewan yang tidak menderita liatu kandung kemih. Sebaliknya istilah ini juga dipergunakan dalam hubungan dengan karsinogen genotok¬sik yang membutuhkan bioaktivasi.

PENELITIAN KARSINOGENISITAS JANGKA PANJANG
Penelitian ini dirancang untuk memperoleh informasi pasti ten¬tang efek karsinogenik berbagai zat kimia pada hewari coba. Ka¬rena besarnya biaya dan waktu yang dibutuhkan, penelitian ini biasanya dilakukan setelah peninjauan data lain, misalnya struk¬tur kimia dan hasil uji mutagenesis jangka pendek dan peneli¬tian toksisitas kronik jangka panjang yang masing-masing diurai¬kan dalam Bab 7 dan Bab 6.
Pedoman pelaksanaan uji karsinogenisitas jangka panjang di¬berikan berikut ini. Uraian rinci dan berbagai acuan dikemuka¬kan dalam sejumlah makalah. (Page, 1977; WHO, 1969; OECD, 1981; U.S. ISGC, 1986).

Hewan: Spesies, Strain, Jenis Kelamin, dan Jumlah
Tikus dan mencit biasanya dipilih karena ukurannya yang kecil, masa hidupnya yang pendek, mudah didapat, dan banyaknya da¬ta mengenai responsnya terhadap karsinogen lain. Marmot juga digunakan terutama dalam penelitian mengenai kanker kandung kemih, payudara, saluran cerna, dan saluran napas (misalnya aki¬bat asap rokok). Anjing dan primata-bukan manusia kadang-ka¬dang digunakan; anjing karena respons positifiiya terhadap 4-ami¬nobifenil dan 2-naftilamin, dan primata karena tingkat filogenetik¬nya yang tinggi. Tetapi penggunaannya terbatas karena ukuran tubuhnya besar dan usianya relatif panjang sehingga membutuh¬kan pajanan zat kimia selama 7 sampai 10 tahun.
Sifat-sifat strain yang dikehendaki adalah (1) dikenal peka terhadap zat yang struktur kimianya serupa, (2) insidens tumor spontannya rendah, dan (3) laju serta pola biotranformasinya sama dengan manusia, kalau diketahui.
Strain yang telah mengalami inbreeding tidak boleh diguna¬kan untuk mencegah kemungkinan insensitivitas. Lebih baik di¬pakai mencit hibrid dari dua strain murni yang jelas karena ke¬mungkinan insensitivitas dari strain murninya tidak ada dan mere¬ka biasanya lebih kuat.
Kedua jenis kelamin harus diikutsertakan dalam penelitian itu; perbedaan respons keduanya terhadap aktivitas karsinogen zat kimia telah banyak diketahui.
Agar terdapat cukup banyak hewan yang hidup sampai mun¬culnya tumor untuk anaiisis statistik, biasanya uji dimulai de¬ngan 50 hewan dari setiap jenis kelamin per kelompok dosis, termasuk kelompok pembanding.

Permulan dan Lamanya
Penelitian biasanya dimulai segera setelah hewan disapih agar pajanan dapat selama mungkin. Kajian pada beberapa generasi dan penggunaan hewan yang hamil untuk menguji efek pada embrio atau fetus juga telah digunakan, tetapi keuntungan dan kerugiannya perlu diteliti lebih lanjut. Masa penelitian biasanya 24 bulan untuk tikus, 18 bulan untuk mencit. Kalau hewan-he¬wan itu berada dalam keadaan yang baik, masa pengujian boleh diperpanjang masing-masing sampai 30 dan 24 bulan.

Cara Pemberian
Zat kimia yang sedang diuji harus diberikan kepada hewan de¬ngan cara yang sama dengan cara pajanan pada manusia. Prin¬sip ini dapat diterapkan pada zat tambahan makanan dan konta¬minan makanan selain juga pada sebagian besar obat-obatan. Un¬tuk zat kimia industri dan lingkungan, pajanan, utama adalah melalui inhalasi. Selain itu, zat kimia yang diuji dapat diberikan melalui penetesan intratrakea.
Zat uji yang akan diberikan secara oral dapat dicampur da¬lam diet, baik dalam kadar tetap (dalam miligram zat per kilogram diet, ppm) atau dalam dosis tetap (dalam miligram zat per kilogram berat badan). Pada cara yang terakhir ini, kadar zat da¬lam diet perlu disesuaikan dengan konsumsi makanan dan berat badan pada interval waktu tertentu. Zat kimia juga dapat dima¬sukkan ke dalam air minum atau diberikan lewat sonde. Makan¬an-jadi untuk hewan mungkin mengandung sejumlah kecil karsi¬nogen (misalnya, aflatoksin) atau penginduksi enzim (misalnya, DDT) yang dapat mengubah efek zat yang diuji.
Aplikasi dermal dipakai untuk zat kimia industri dan obat¬-obatan yang digunakan topikal. Cara ini terutama dimaksudkan untuk mendeteksi karsinogenisitas lokal. Namun, pada beberapa kasus, terjadi penyerapan yang cukup sehingga terjadi efek sis¬temik. Pemilihan pelarut juga penting: pelarut itu harus tanpa atau hanya mempunyai sedikit toksisitas, dan tidak bereaksi de¬ngan zat kimia yang diuji. Yang sering dipergunakan adalah di¬metilsulfoksid (DMSO).
Pemberian parenteral lewat injeksi intravena, intraperitoneal, atau subkutan jarang digunakan dan hanya digunakan bila ada alasan khusus. Jalur jalur ini tidak praktis dan hasilnya dapat di¬kacaukan oleh reaksi lokal.

Dosis
Pada uji karsinogenisitas ini biasanya dipakai dua atau tiga ting¬kat dosis. Selain itu, diikutsertakan juga kelompok pembanding. Dosis dipilih berdasarkan data penelitian jangka pendek dan da¬ta metabolisme agar dosis cukup tinggi untuk menghasilkan se¬dikit tanda toksisitas tetapi tidak sampai memperpendek masa hidup hewan-hewan itu. Dua dosis yang lebih rendah biasanya ditentukan sepersekian dari dosis tertinggi (misalnya 1/2 atau 1/4) dan diharapkan akan memungkinkan hewan-hewan itu terus hi¬dup dalam keadaan sehat atau sampai tumor muncul.
Dosis maksimal yang dapat ditoleransi (Maximally tolerated dose = MTD) biasanya dipakai sebagai dosis yang tinggi. Ini diperhitungkan dari penelitian 90 hari dan didefinisikan sebagai dosis yang (1) tidak akan menimbulkan toksisitas secara morfo¬logik sedemikian besar sehingga mempengaruhi interpretasi penelitian jangka panjang, dan (2) tidak merupakan bagian yang begitu besar dalam diet hewan itu sehingga mengakibatkan ketidakseimbangan gizi (U.S. ISGC, 1986).
Secara umum, kriteria ini tampak memuaskan untuk seleksi besarnya dosis. Meskipun demikian untuk zat kimia tertentu, se¬perti dibahas dalam bagian berikut ini, dosis yang dipilih mung¬kin menyebabkan kerusakan luas pada organ tubuh atau mem¬bebani mekanisme biotransformasi normal pada hewan tersebut. Dalam hat ini, diperlukan evaluasi kritis terhadap basil uji atau bahkan percobaan perlu diulang pada dosis yang lebih rendah.

Pembanding dan Pemberian Kombinasi Zat-zat Kimia
Kelompok pembanding yang tanpa obat terdiri atas jumlah he¬wan yang sama besar atau lebih besar dari setiap kelompok per¬lakuan. Selain pembanding negatif ini, harus diikutsertakan juga kelompok lain yang diberi zat yang telah diketahui bersifat karsi¬nogenik pada dosis tertentu. Pembanding positif membuat basil uji lebih handal karena bertindak sebagai bukti sensitivitas kelom¬pok hewan yang dipakai, di samping sebagai bukti bahwa fasili¬tas dan prosedur dalam laboratorium itu telah memadai. Kelom¬pok pembanding ini sedikit banyak juga akan menunjukkan po¬tensi relatif zat kimia yang diuji. Bila akan digunakan suatu pe¬larut misalnya aseton atau dimetilsulfoksid, efek yang mungkin timbul juga harus diuji dalam sekelompok hewan.
Pentingnya pembanding historik telah ditekankan oleh Task Force, Society of Toxicology (1982).
Suatu zat kimia mungkin diberikan pada hewan coba ber¬sama dengan karsinogen yang telah diketahui. Ini dilakukan bila zat yang diuji mempunyai efek karsinogenik lemah dan manusia mungkin terpajan pada kedua bahan itu dalam kehidupan nyata. Ini juga dilakukan bila zat yang diuji itu diperkirakan akan me¬ngubah efek karsinogen lingkungan lainnya.

Pengamatan dan Pemeriksaan
Berat Badan dan Konsumsi Makanan Diketahuinya berat badan dan konsumsi makanan memungkinkan kita menghitung asupan zat kimia dalam miligram per kilogram berat badan. Se¬lain itu, berat badan merupakan petunjuk peka untuk status kesehatan hewan sehingga harus diukur setiap minggu selama tiga bulan pertama, ketika hewan itu sedang tumbuh, dan setiap 2 minggu setelah itu.
Pengamatan Umum Hewan harus diamati setiap hari un¬tuk melihat ada tidaknya hewan yang mati atau sakit. Hewan yang mati dan sakit harus disingkirkan dari kandang untuk di¬periksa secara makroskopis dan diperiksa secara mikroskopik bila keadaan jaringan memungkinkan.
Hewan yang sakit harus ditaruh di dalam kandang tersendiri sebagai karantina dan untuk mencegah kanibalisme. Kalau ada indikasi, hewan itu boleh diobati dengan obat-obatan, tetapi se¬tiap terapi harus dicatat. Pengobatan jangka panjang harus dihin¬dari untuk menyingkirkan kemungkinan pengaruhnya terhadap efek zat yang sedang diuji.
Mulanya, letak, ukuran, dan pertumbuhan setiap massa ja¬ringan yang aneh harus diperiksa dengan cermat dan dicatat. Tan¬da-tanda toksisitas dan efek farmakologik juga hanis dicatat.
Uji Laboratorium Berbeda dengan penelitian toksisitas jang¬ka pendek dan jangka panjang yang semua efek toksiknya ha¬rus diteliti, tujuan utama penelitian karsinogenisitas adalah me¬nentukan aktivitas karsinogen suatu zat kimia. Karenanya, demi kesehatan hewan-hewan itu, kecuali pemeriksaan hematologik standar, tidak banyak uji laboratorium dilakukan. Ini dilakukan pada akhir penelitian. Ka1au diperlukan uji laboratorium pada per¬tengahan penelitian, maka hewan coba harus ditambah.
Pemeriksaan Pascamati Semua hewan yang ditemukan mati atau sekarat harus diperiksa secara makroskopik melalui autopsi. Hewan yang bertahan hidup pada akhir penelitian kemudian di¬bunuh dan diperiksa. Di samping itu, sejumlah alat tubuh harus ditimbang, termasuk hati, ginjal, jantung, testes, dan otak.
Contoh dari semua jaringan harus diawetkan untuk diperik¬sa secara histologik. Pemeriksaan mikroskopik harus dilakukan pada semua pertumbuhan tumor dan semua jaringan yang seca¬ra makroskopik menunjukkan kelainan. Biasanya jaringan berikut ini juga diperiksa: kelenjar limf mandibuler, kelenjar ludah, ke¬lenjar payudara, sternebra, femur atau vertebra (termasuk sum-sumnya), timus, tiroid, paratiroid, trakea, Paru-paru dan bronkus utama, jantung, esofagus, lambung, usus halus, kalon, hati, kan¬dung empedu, pankreas, limpa, adrenal, ginjal, kandung kemih, prostat, testes, uterus, ovarium otak (tiga potongan), pituitari, ma¬ta (kalau ada kelainan nyata), dan sumsum tulang belakang (bila ada tanda-tanda neurologik).
Pelaporan Tumor Beberapa istilah yang biasa dipakai un¬tuk menjelaskan tumor, misalnya hepatoma, mengandung penger¬tian yang luas. Karenanya, uraian rinci mengenai gambaran pa¬tologik lesi-lesi itu amat berharga.
Karena karsinogenesis dapat muncul dalam berbagai bentuk (lihat “Definisi"), hal-hal berikut perlu dicatat.
1. Jumlah berbagai jenis tumor (,baik jinak maupun ganas), dan semua tumor yang tidak normal
2. Jumlah hewan yang mengandung tumor
3. Jumlah tumor pada setiap hewan
4. Permulaan munculnya tumor bila dapat ditentukan

UJI SARlNG CEPAT
Uji Jangka Pendek untuk Mutagenesis/Karsinogenesis
Dalam tahun-tahun terakhir ini, sejumlah uji yang relatif seder¬hana dan jauh lebih singkat telah dirancang dan dipakai untuk mendeteksi aktivitas mutagenisitas zat kimia. Uji-uji ini meng¬gunakan berbagai jenis sistem, termasuk mikroba, serangga, sel mamalia, di samping serangkaian parameter seperti mutasi gen, efek kromosom, dan perbaikan DNA. Uji mutagenesis dan uji yang menggunakan transformasi sel sebagai parameter akan di¬uraikan dan dibahas pada bab berikut.
Meskipun tidak semua mutagen bersifat karsinogenik, atau sebaliknya, hubungan antara dua aktivitas ini begitu dekat se¬hingga uji mutagenesis sering dilakukan sebagai uji saring cepat bagi zat kimia unwk menentukan potensi karsinogenisitasnya. Untuk memperbaiki kehandalan hasilnya, biasanya dilakukan se¬rangkaian uji semacam ini (misalnya US ISGC, 1986); Weisburger dan Williams (1981) mengusulkan uji in vitro jangka pendek berikut ini: (1) mutagenesis bakteri, (2) mutagenesis mama¬lia; (3) perbaikan DNA, (4) kerusakan kromosom, dan (5) trans¬formasi sel. Hasil-hasil uji ini juga berguna dalam menentukan mekanisme kerja.

Uji untuk Promotor
Kulit tikus telah lama dipakai sebagai model untuk menguji pro¬motor seperti dibahas di dalam bagian terdahulu. Akhir-akhir ini telah dikembangkan uji untuk promotor pada organ lain, misal¬nya kolon, kelenjar payudara, hati, pankreas, dan kandung ke¬mih. Untuk perincian lebih lanjut lihat Pereira (1983).

Uji Karsinogenisitas Terbatas
Uji karsinogenisitas terbatas telah diusulkan oleh Williams dan Weisburger (1986) karena adanya beberapa keuntungan. Uji ini lebih baik daripada uji mutagenesis dalam arti bahwa titik akhir adalah pembentukan tumor. Selain itu, waktu yang diperlukan un¬tuk uji ini jauh lebih pendek daripada waktu untuk penelitian karsinogenisitas jangka panjang.
Tumor Kulit pada Mencit Kulit mencit bereaksi terhadap pemberian zat kimia secara topikal, misalnya hidrokarbon aro¬matik polisiklik serta ter dari batu bara dan minyak bumi, yang menimbulkan papiloma dan karsinoma. Prosedur yang diperke¬nalkan oleh Berenblum dan Shubik (1947) ini telah digunakan secara luas. Kulit mencit bereaksi secara positif mungkin karena kulit itu mempunyai enzim yang mengubah zat-zat menjadi me¬tabolit aktif.
Beberapa zat kimia bertindak sebagai inisiator dan sekaligus sebagai promotor; zat ini dapat disebut karsinogen lengkap. Ba¬han lainnya terutama, atau semata-mata, bekerja sebagai inisia¬tor. Karsinogenisitasnya hanya muncul setelah pemberian suatu promotor. Kumpulan literatur mengenai efek zat kimia sebagai inisiator dan promotor pada uji kulit mencit telah dihimpun oleh Pereira (1982).
Tumor Paru-paru pada Mencit Mencit strain A hampir 100% secara spontan menderita tumor pana-paru pada usia 24 bulan. Hasil positif dari karsinogen dapat diperoleh pada sekitar 24 minggu sewaktu tumor hanya ditemukan pada beberapa he¬wan pembanding saja. Pada beberapa zat kimia, uji dapat dise¬lesaikan dalam 12 minggu (Shimkin dan Stoner, 1975).
Perubahan Nlakroskopik pada Hati Tikus Telah diperli¬hatkan bahwa terjadi perubahan mikroskopik nyata sebelum mun¬culnya hepatokarsinoma. Kelainan-kelainan ini resisten terhadap penimbunan besi, suatu fenomena yang dapat dikenali secara his¬tokimia. Juga ada kelainan dalam enzim tertentu yang dapat di¬tunjukkan secara histokimia. Perubahan yang terakhir ini terjadi pada tikus tetapi tidak pada mencit. Kelainan mikroskopik ini dapat dideteksi dalam 3 minggu setelah pajanan dan muncul le¬bih banyak setelah 12-16 minggu (Goldfarb dan Pugh, 1982).
Kanker Payudara pada Tikus Betina Hidrokarbon poli¬siklik dapat menginduksi kanker payudara pada tikus betina mu¬da strain Sprague-Dawley dan Wistar. Tumor dapat terbentuk kurang dari 6 bulan (Huggins dkk. 1959).

PETANDA BIOLOGIK
Seperti disebut di atas, karsinogenesis melibatkan tiga tahap uta¬ma: inisiasi, promosi, dan konversi serta progresi. Kini sedang dikembangkan cara pengenalan petanda biologik untuk berbagai tahap ini. Minat akan petanda ini berkembang dari potensial ke¬gunaannya untuk menyelidiki cara kerja karsinogen, untuk me¬nentukan pajanan karsinogen, dan diagnosis dini kanker. Berikut adalah diskusi singkat mengenai bidang yang sedang berkembang pesat ini.

Petanda biatagik Pajanan dan Inisiasi
Inisiasi berhubungan dengan pengikatan kovalen karsinogen elek¬trofilik atau metabolit aktifnya pada DNA. Adanya carcinogen¬ DNA adduct dapat diperlihatkan dan diukur dengan karsinogen yang diberi label radioaktif. Inisiasi dapat juga ditentukan de¬ngan menggunakan radioimunoasai, tanpa menggunakan karsino¬gen radioaktif. Karenanya, prosedur ini dapat digunakan bila dicu¬rigai manusia terpajan suatu karsinogen. Prosedur ini telah di¬gunakan untuk menentukan pajanan aflatoksin B1, benzo[a]piren, dan nitrosamin tertentu (Wogan, 1989).

Petanda Biologik Promosi
Promosi telah dipelajari secara sangat mendalam pada karsino¬genesis kulit. Bila- diberi promotor, yang paling aktif di antara¬nya adalah TPA (12-O-tetradekanoil forbol 13-asetat), sel yang telah diinisiasi maupun sel normal mengalami berbagai jenis pe¬rubahan biokimia. Perubahan itu antara lain berupa penumpukan aktivator plasminogen dan meningkatnya sintesis prostaglandin. Tumor hati yang diinisiasi oleh asetil-aminofluoren (AAF) ter¬bukti dapat dipromosikan oleh fenobarbital, DDT, bifenil poli¬klorin (PCB), dan butil hidroksitoluen (BHT). Enzim tertentu (misalnya glukosa 6-fosfatase dan adenosin trifosfatase) berku¬rang, sementara lainnya (misalnya, γ-glutamil transpeptidase, glu¬tation S-transferase-P) meningkat. Perubahan biokimiawi ini dan perubahan lainnya sedang dipelajari untuk menentukan perannya sebagai petanda praneoplasma dalam hati.

Petanda Tumor
α-Fetoprotein (AFP) merupakan suatu produk hati janin dan he¬patokarsinoma. Zat ini sering juga, meskipun tidak selalu, di¬produksi oleh tumor testis, indung telur, dan organ lain. Namun, zat ini merupakan alat yang berguna dalam klinik. Contohnya, AFP telah digunakan secara luas dalam penyaringan karsinoma hepatoselular, sehingga memungkinkan deteksi serta terapi yang dini (Tang dkk., 1980). Human Chorionic Gonadotropin (HCG) merupakan petanda yang sensitif dan dapat digunakan untuk de¬teksi kanker pada fase subklinis. Karsinoma payudara sering di¬sertai meningkatnya kadar parameter biokimiawi seperti carcino¬embryonic antigen, feritin,'dan C-reactive protein. Sayangnya, pe¬rubahan ini biasanya hanya terlihat bila tumor telah mengalami metastasis sehingga telah terlambat untuk diagnosis dini kanker. Namun, semua itu berguna untuk menilai efek terapi dan untuk mengikuti adanya remisi atau kekambuhan seperti diperlihatkan oleh Fritsche (1982) dan lain-lain.

EVALUASI
Penilaian Pendahuluan
Berbagai jenis informasi dapat digunakan dalam evaluasi pendahuluan mengenai potensi karsinogenik suatu zat kimia.
Struktur Kimia Sejumlah zat kimia diketahui bersifat karsinogenik. Suatu daftar karsinogen manusia yang dikenal dan dicurigai disajikan dalam Apendiks 7-1. Selain itu, sejumlah be¬sar zat kimia telah terbukti bersifat karsinogen pada hewan (lihat "Karsinogen Genotoksik"). Zat kimia yang strukturnya mirip de¬ngan salah satu karsinogen/mutagen itu tidak selalu bersifat karsi¬nogenik; tetapi zat kimia tersebut harus diberi prioritas utama dalam program pengujian karsinogenisitas. Faktanya, struktur ki¬mia tertentu memang terbukti berkorelasi dengan karsinogenisi¬tas (Ashby dan Tennant, 1988).
Mutagenisitas Pada dasarnya, zat mutagenik menghasilkan perubahan genetik yang diturunkan lewat pengaruhnya terhadap DNA. Jadi, cara kerjanya mirip dengan cara kerja karsinogen ge¬notoksik. Uji mutagenisitas juga memberi informasi mengenai cara kerja di samping informasi mengenai apakah aktivasi me¬tabolik dibutuhkan untuk mutagenisitas. Meskipun hasil positif dalam uji ini tidak merupakan bukti positif bahwa zat kimia itu bersifat karsinogenik, hasil itu menunjukkan bahwa dibutuhkan pengujian yang lebih mendalam. Di lain pihak, hasil negatif tidak membuktikan keamanan suatu zat kimia.
Uji Karsinogenisitas Terbatas Hasil akhir uji ini adalah pembentukan tumor. Karena itu, zat kimia tertentu, misalnya ko¬karsinogen yang memberi hasil negatif aalam uji mutagenesis, dapat positif dalam uji ini. Hasil positif pada lebih dari satu uji karsinogenisitas terbatas ini dapat dianggap sebagai bukti kua¬litatif yang pasti tentang karsinogenisitas.
Bull dan Pereira (1982) mengusulkan agar matriks penguji¬an karsinogenesis mencakup uji mutagenesis dan karsinogenesis terbatas berikut ini: (1) inisiasi/promosi kulit mencit, (2) ade¬noma paru-paru mencit strain A, (3) kelainan mikroskopik hati tikus, (4) transformasi sel, dan (5) pertukaran kromatid in vivo.


Penilaian Definitif
Data penelitian karsinogenisitas jangka panjang yang dirancang dengan baik dan dilaksanakan dengan tepat biasanya memberikan suatu dasar yang kuat untuk menilai potensi karsinogen.
Pertimbangan Umum Hasil penelitian ini biasanya lebih dapat dipercaya daripada hasil uji saring cepat. Tetapi kepastian hasil bergantung pada sejumlah faktor. Contohnya, bila sangat se¬dikit hewan yang hidup pada saat terbentuknya tumor, data su¬lit dianalisis secara statistik. Peristiwa ini mungkin terjadi kare¬na tidak cukup banyak hewan dalam tiap kelompok dosis dan atau terlalu banyaknya hewan yang mati akibat penanganan yang kurang benar atau akibat toksisitas zat kimia yang diberikan pada dosis yang terlalu tinggi.
Kecermatan pemeriksaan postmortem juga amat berperan. Ini berlaku untuk pemeriksaan makroskopis dan mikroskopik. Tumor dalam jaringan dan organ dapat terlewatkan kalau hanya dipe¬riksa sambil lalu. Mungkin dibutuhkan teknik khusus untuk pe¬meriksaan organ tertentu, misalnya kandung kemih. Kejadian yang muncul bersamaan, misalnya adanya batu dan parasit dalam kan¬dung kemih, harus dicari dan dicatat ada atau tidaknya.
Insidens Tumor Seperti dicatat pada permulaan bab ini, karsinogenesis dapat muncul sebagai salah satu dari empat ben¬tuk. atau kombinasinya. Bentuk yang paling biasa adalah pe¬ningkatan jumlah hewan yang mempunyai tumor. Munculnya tu¬mor yang tidak biasa merupakan peristiwa penting kalau jumlahnya cukup banyak; bila hanya satu atau hanya sedikit yang dideteksi, dibutuhkan pemeriksaan kritis lebih jauh. Memendek¬nya masa laten dengan mudah terlihat pada tumor kulit dan tumor subkutan. Masa laten tumor viseral, pada prakteknya, sama dengan masa hidup hewan itu karena tumor umumnya baru di¬diagnosis pasti pada saat autopsi. Bila jumiah tumor per hewan meningkat tetapi jumlah hewan yang mempunyai tumor tidak meningkat, biasanya ini menunjukkan kokarsinogenisitas saja.
Tumor pada hewan coba mungkin tidak berada dalam tahap perkembangan yang sama. Mungkin ditemukan dalam tahap hiper¬plasia atipik, tumor jinak, karsinoma in situ, invasi jaringan se¬kitarnya, atau metastasis ke bagian tubuh lainnya. Tumor yang sama jenisnya tetapi berbeda tahapnya harus ditabulasi secara ter¬pisah, tetapi kemudian harus digabungkan untuk analisis statistik.
Hubungan Dosis-Respons Biasanya, hubungan dosis-respons yang positif akan kentara. Namun, dalam kelompok dosis tinggi insidens tumor mungkin lebih rendah. Fenomena ini biasanya ter¬jadi akibat sedikitnya hewan yang dapat hidup karena pengaruh efek-efek toksik zat kimia.
Reprodusibilitas Hasil Suatu uji karsinogenisitas lebih da¬pat dipercaya kalau basil yang serupa diperoleh pada strain he¬wan lain. Berulangnya basil pada spesies lain ini bahkan lebih bermakna. Akan tetapi, kalau diperoleh basil negatif pada spesies lain, fakta ini tidak dapat menghapuskan penemuan yang positif, melainkan menunjukkan bahwa diperlukan penyelidikan lebih jauh. Misalnya, mungkin ada perbedaan dalam biotransformasi zat ter¬sebut atau ada variasi dalam komposisi produk yang digunakan. Di lain pihak, penemuan positif dalam satu percobaan pantas di¬curigai kalau beberapa percobaan lain yang identik semuanya mem¬beri basil negatif.

Evaluasi Keamanan/Risiko
Berbagai pendekatan yang digunakan dalam evaluasi keamanan/ risiko karsinogen dibahas dalam Bab 22. Akan tetapi, butir-butir berikut ini perIu ditekankan.
Pertama, meskipun uji yang dirinci di atas merupakan suatu dasar berharga untuk penilaian risiko/keamanan, data lain yang berhubungan dengan cara kerja dan pengaruh faktor pemodifikasi juga penting (US ISGC, 1986). Perbedaan nyata antara karsinogen genotoksik dan epigenetik juga dipertimbangkan sebagai ala¬san sah untuk menilai risiko mereka secara berbeda (lihat Wil¬liams, 1994). Namun, suatu zat kimia, misalnya kloroform, da¬pat bertindak sebagai karsinogen epigenetik selain sebagai kar¬sinogen genotoksik.
Selain itu, ada zat kimia yang memperlihatkan karsinogeni¬sitas sekunder terlaadap efek biologik non-karsinogenik atau efek fisik yang hanya muncul pada dosis yang tidak pernah dapat dicapai dalam kehidupan sehari-hari. Umumnya disepakati bah¬wa ada ambang dosis untuk karsinogen sekunder semacam itu (Lu, 1976; Munro, 1988). US ISGC (1986) juga memperingatkan bahwa dosis toksikan yang sangat tinggi dapat mengakibatkan penyebaran, detoksikasi, dan eliminasi toksikan yang berbeda se¬cara kualitatif. Karena itu respons pada dosis semacam itu mungkin tidak dapat diterapkan pada keadaan sehari-hari yang lebih rea¬listis. Selain itu, bukti kerusakan jaringan yang luas, gangguan fungsi hormon, pembentukan batu saluran kencing, dan kejenuhan fungsi perbaikan DNA harus ditinjau dengan seksama (US ISGC, 1986).
Karsinogen juga berbeda-beda potensi dan masa latennya. Beberapa karsinogen hanya aktif pada spesies tertentu, sementa¬ra yang lainnya mempengaruhi beberapa spesies dan strain he¬wan. Semua faktor. ini harus dipertimbangkan dalam menilai ke¬amanan/risiko karsinogen.
Akhirnya, penting untuk diingat kembali bahwa berbagai zat kimia itu amat berbeda-beda nilainya bagi manusia. Contohnya, penggunaan suatu pewarna makanan perlu ditunda bila berda¬sarkan data yang ada dicurigai adanya karsinogenisitas. Di lain pihak, sekalipun ada bukti karsinogenisitas pada manusia, obat penyelamat jiwa masih dapat digunakan dalam klinik. Juga ada karsinogen lingkungan, termasuk karsinogen dalam makanan, yang tidak dapat disingkirkan dengan teknologi yang ada seka¬rang ini (lihat juga Ames. 1989).


Bab 8
Mutagenesis

PENGANTAR
Mutagenesis dapat terjadi akibat interaksi antara zat mutagen dan zat genetik organisme. Meskipun mutasi spontan dan seleksi alam merupakan cara evolusi utama, dalam dasawarsa akhir-akhir ini sejumlah toksikan terbukti bersifat mutagen bagi berbagai jenis organisme.

Bahaya bagi Kesehatan
Pada saat ini efek akhir pajanan manusia terhadap berbagai zat mutagen ini belum dapat diramalkan. Namun, sebagian aborsi spontan, kelahiran mad, dan penyakit turunan AM terbukti ber¬kaitan dengan perubahan dalam molekul-molekul DNA dan de¬ngan aberasi kromosom. Ada sekitar 1000 mutasi gen dominan yang bertanggung jawab untuk berbagai penyakit, terrnasuk neo¬plasma turunan, misalnya retinoblastoma bilateral; jumlah kelain¬an gen resesif, misalnya anemia sel-sabit, fibrosis kistik, dan pe¬nyakit Tay-Sachs, kurang lebih sama. Selain itu, aberasi kromo¬som berhubungan dengan penyakit, misalnya sindroma Down, sin¬droma Klinefelter, dan sindroma Turner. Diperkirakan penyakit¬-penyakit itu akan muncul dengan insidens 0,5% di antara kelahir¬an hidup di Amerika Serikat. Di lingkungan, efek mutagen apa¬pun hanya dapat nyata setelah selang waktu beberapa generasi. Karena masalah ini merupakan persoalan yang serius, diperlukan penyelidikan luas dalam berbagai bidang mutagenesis.
Sejumlah penyakit manusia merupakan akibat cacatnya. sistem perbaikan DNA. Contohnya, pasien dengan xeroderma pigmentosa kekurangan perbaikan eksisi dalam kulit; mereka rentan terhadap cahaya ultraviolet dan banyak karsinogen kimia; karenanya tumor kulit mudah berkembang pada mereka. Pasien dengan ataxia tel¬angiektasia mempunyai defisiensi semacam itu dalam sistem lim¬foidnya dan diketahui rentan terhadap sinar-X dan karsinogen me¬til nitronitrosoguanidin. Anemia fanconi berhubungan dengan ca¬catnya perbaikan DNA dalam darah dan tulang rangka. Orang yang menderitanya rentan terhadap mitomisin-C dan psoralen. Pe¬nyakit ini dan beberapa penyakit lain yang berhubungan telah di¬bahas oleh Cleaver (1980).
Selain itu, uji untuk mutagenisitas pada tahun-tahun belakang¬an ini telah lebih banyak dipergunakan karena nilainya sebagai suatu penyaring cepat untuk karsinogenisitas (lihat Bab 7). Per¬kembangan ini terutama muncul dari fakta bahwa sebagian besar mutagen terbukti bersifat karsinogen. Selain itu, uji ini, dengan berbagai jenis titik akhirnya, berguna untuk mempelajari lebih lanjut cara kerja karsinogen.

Kategori Mutagenesis dan Ujinya
Telah dikenal bahwa DNA, yang terdiri atas basa-basa nukleotid, berperan penting dalam genetika. Pertama, DNA meneruskan in¬-formasi genetik dari satu generasi sel kepada generasi berikutnya melalui replika diri sendiri. Ini dikerjakan dengan memisahkan untai ganda molekul DNA dan mensintesis untai anak yang baru. Kedua, informasi keturunan yang disandi dalam molekul DNA di¬ekspresikan lewat transkripsi satu untai RNA yang melengkapi satu untai DNA, yang berfungsi sebagai templat, dan kemudian menerjemalikan informasi dari RNA menjadi asam-asam amino dalam protein, Setiap tiga basa nukleotid, disebut kodon, mene¬tapkan satu asam amino. Kerusakan pada urutan basa ini akan mengubah susunan asam amino pada protein yang disintesis.
Dalam penelitian yang lebih dahulu, aktivitas mutagen ter¬utama ditunjukkan dalam lalat buah dan ujung akar bawang ka¬rena teknik yang dibutuhkannya lebih sederhana. Baru-baru ini, banyak sistem uji baru telah dikembangkan. Sistem uji ini ber¬beda-beda kompleksitasnya, dari mikroorganisme sampai mamalia utuh. Penggunaan organisme yang begitu berbeda-beda ini dida¬sarkan pada fakta bahwa semua DNA untai-ganda mempunyai ci¬ri-ciri biokimia yang serupa, yang dicantumkan dalam Tabel 8-1.
Pada masa kini, ada lebih dari 100 sistem uji. Sejumlah uji

Tabel 8-L Ciri Biokimia Basar dari Semua DNA Untai-Ganda
1. DNA terdiri atas dua macam purin yang berbeda (guanin, adenin) dan dua pi¬rimidin yang berbeda (timirt dan sitosin).
2. Suatu pasangan nukleotid terdiri atas satu purin dan satu pirimidin jadenin/ timin (A-T’) atau guaninlsitosin (G-C)].
3. Pasangan nukleotid dihubungkan menjadi suatu molekul spiral ganda oleh hubungan utama gula-fosfat dan ikatan hidrogen.
4. Pasang basa A-T diikat oleh dua ikatan hidrogen, tetapi G-C diikat oleh ti¬;a ikatan.
5. Jarak antara tiap pasangan basa dalam suatu molekul adalah 3,4 A, meng¬hasilkan 10 pasangan nukleotid per kelokan spiral DNA.
6. Dalam molekul DNA, jumlah moleku) adenin harus sama dengan jumlah molekul timin. Hubungan yang setupa berlaku untuk molekul guanin dan si¬tosin. Namun, rasio pasangan basa A-T terhadap G-C dapat berubah dalam DNA dan spesies yang berbeda.
7. Dua untai spiral ganda saling melengkapi dan antiparalel dalam segi polari¬tas dua tulang punggung gula-fosfat, satu untai menjadi 3'-5' dan lainnya 5'¬-3' dari segi gugus OH akhir pada gula ribosanya.
8. DNA bereplikasi dengan metode semikonservatif yaitu dua untai berpisah dan tiap untai digunakan sebagai templat untuk mensintesis untai pasangan¬nya yang baru.
9. Laju polimerisasi nukleotid DNA selama replikasi kira-kira 600 nukleotid per detik. Spiral harus melepaskan dizi memhentuk templat dengan laju 3600 puraran semenit untuk menyesuaikan diri dengan laju replikasi ini.
10. Isi DNA dalam sel bervariasi (1,8 x 109 dalton untuk Escherichia coli sam¬pai 1,9 x 1011 dalton untuk sel manusia).

diuraikan dalarn bab ini di bawah empat kategori utama, yaitu mutasi gen, efek kromosom, perbaikan dan rekombinasi DNA, dan lain-lain. Karena ringkasnya uraian ini, sekurang-kurangnya satu rujukan akan dikutip untuk tiap uji. Rujukan lain dan rin¬cian lebih lanjut diberikan di sini dan di tempat lain (EPA, 1989; OECD (1987).

MUTASI GEN
Mutasi gen terjadi karena penambahan atau penghilangan (dele¬tions) pasangan basa, atau penggantian pasangan basa yang keliru dalam molekul DNA.
Penggantian terdiri atas transisi dan transversi. Transisi meli¬batkan penggantian suatu purin (adenin, guanin) oleh purin lain atau suatu pirimidin (sitosin, timin) oleh pirimidin lain. Dalam transversi, purin digantikan oleh pirimidin, atau sebaliknya.
Bila jumlah pasangan basa yang ditambahkan atau dihapus¬kan tidak merupakan suatu perkalian tiga, urutan asam amino dari protein yang disandi di bagian distal adisi atau delesi itu akan berubah. Fenomena ini disebut mutasi pergeseran-rangka (frame-shift mutation) dan mungkin akan mempengaruhi sifat bio¬logi protein itu. Gambar 8-1 dengan jelas mengilustrasikan efek delesi dan adisi dari suatu basa nukleotid.
Selain itu, mutagen dapat masuk ke dalam molekul DNA; hal ini dapat juga menyebabkan kesalahan dalam pemasangan basa. Berbagai perubahan dalam molekul DNA ini dapat me¬nyebabkan penggantian suatu asam amino baru dalam molekul protein yang disandi, atau menghasilkan urutan asam amino yang berbeda dalam protein yang disintesis. Lebih lanjut, mungkin terbentuk suatu kodon penutup/pemutus sintesis protein, sehingga di¬hasilkan protein yang lebih pendek. Perubahan yang pertama da¬pat berakibat perubahan, sifat biologi molekul protein maupun ti¬dak, tetapi dua perubahan yang terakhir ini hampir selalu menye¬babkan perubahan sifat biologi.

Uji Mikroba In Vitro


Gambar 8-1 Mutasi pergeseran kerangka akibat delesi atau insersi basa nukleotid. Serangkaian kodon baru dibentuk pada bagian distal dari tempat delesi atau insersi. sehingga terbentuklah asam amino baru dalam protein (Dari Bru¬sick, 1987)

Mikroorganisme Prokariotik Mikroorganisme ini terdiri atas berbagai strain bakteri. Untuk mendeteksi adanya mutasi titik, bakteri yang biasa digunakan adalah Salmonella typhimurium dan Escherichia coli. Sebagian besar sistem bakteri dimaksudkan un¬tuk mendeteksi mutasi balik. Contohnya, uji Ames (Ames, 1971) mengukur reversi mutan S. tvphimurium yang bergantung-histidin menjadi jenis liar yang tidak bergantung pada histidin. Mutan di¬inkubasi dalam suatu perbenihan yang tidak cukup mengandung histidin sehingga pertumbuhan tidak kelihatan. Ka1au toksikan yang ditambahkan pada perbenihan itu mampu menginduksi mutasi ba¬ik, maka bakteri itu dapat menjadi tidak tergantung histidin dan dapat tumbuh dalam perbenihan yang kekurangan histidin itu.
Biasanya digunakan beberapa strain karena spesifisitas. Mutasi ini tetjadi akibat pergeseran rangka (frame-shift) atau substitusi pa¬sangan basa; mutagen yang berbeda dapat mempengaruhi satu strain tetapi tidak mempengaruhi strain lain.
Sejumlah strain S. typhimurium dibuat menjadi lebih peka terhadap efek mutagen melalui perubahan permeabilitas dinding selnya (yang kekurangan lipopolisakarid), perubahan kemampuan memperbaiki pemotongan DNA (melalui delesi khusus dalam mo¬lekul DNA), dan faktor resistensi-ampisilin (Ames dkk., 1975; McCann dkk., 1975).
Karena banyak mutagen bersifat non-aktif sebelum bioaktiva¬si, maka pengujian itu mungkin memerlukan suatu sistem bioakti¬vasi. Sistem bioaktivasi itu biasanya terdiri atas fraksi mikrosom (mengandung sistem mixed-function oxidase) dari hati. tikus atau hewan lain, meskipun hati manusia juga digunakan untuk tujuan khusus. Aktivitas enzim mikrosom biasanya meningkat bila hewan diberi pra-perlakuan dengan zat penginduksi, misalnya 3-metilkol¬antren, fenobarbital, atau bifenil poliklorin (PCB). Kofaktor yang tepat juga ditambahkan ke dalam campuran sebelum inkubasi.
Strain E. coli yang mengalami berbagai tingkat defisiensi me¬kanisme perbaikan DNA juga digunakan dalam uji mutagenesis. E. coli jenis liar lebih mampu mengatasi efek mutagen pada DNA lewat mekanisme perbaikan yang normal, sementara mutan¬nya tidak dapat. Meskipun kebanyakan sistem mikroba dirancang untuk mendeteksi mutasi balik, E. coli strain Mohn dapat mende¬teksi mutasi maju, misalnya, resistensi terhadap 5-metiltriptofan (Mohn dkk., 1974).
Mikroorganisme Eukariotik Strain tertentu Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Neurospora, dan Aspergilus telah dikem¬bangkan untuk terutama mendeteksi mutasi balik dan, pada ting¬kat terbatas, mutasi maju. Seperti sistem bakteri, umumnya sis¬tem ini juga melibatkan enzim bioaktivasi dan kofaktor. Contoh¬nya, suatu jenis mutan Saccharomyces cerevisiae membutuhkan adenin dan menghasilkan koloni berpigmen-merah, sementara mik¬roorganisme jenis liar tidak tergantung pada adenin dan mem¬produksi kolom putih. Dengan demikian mutasi balik dapat diten¬tukan oleh prevalensi koloni putih (Bnisick dan Mayer, 1973).
perantaraan-pejamu, sel sasaran disuntikkan ke dalam hewan yang menerima zat kimia yang akan diuji (Fischer dkk., 1974).

Uji Mutasi Gen pada Mencit
Uji Lokus Khusus. Uji lokus khusus dikembangkan oleh Russell (1951) untuk menentukan mutagenisitas radiasi ion pada sel germinal. Prosedur ini kemudian diadaptasikan untuk menilai mutagenisitas zat kimia (Searle, 1975). Kelebihan uji ini adalah mendeteksi secara langsung pada marnaIia utuh efek mutagen tok¬sikan pada sel germinal, tetapi biasanya dibutuhkan hewan yang sangat banyak.
Uji ini dilakukan dengan memajankan mencit nonmutan ter¬hadap zat kimia dan sesudah itu mengawinkannya dengan he¬wan yang resesif-ganda. Keturunannya akan berubah fenotipenya vang ditunjukkan oleh warna rambut, struktur rambut, warna ma¬ta, paniang telinga, dan ciri-ciri lain. Beberapa mutan merupakan mosaik dan bukan hewan lengkap. Mutasi dapat juga dideteksi oleh penolakan atau penerimaan cangkokan kulit yang dilakukan antara keturunan generasi pertama. Mutasi ini dapat lebih jauh digolongkan secara imunogenetik (Bailey dan Kohn, 1965).
Uji Bercak Mencit Pengujian ini dirancang untuk mende¬teksi mutasi gen pada sel somatik. Pada dasarnya uji ini dilaku¬kan dengan memberi perlakuan mencit hamil yang embrionya he¬terozigot pada lokus untuk wama kulit khusus, dan kemudian memeriksa bayir.ya yang baru lahir untuk melihat ada tidaknya bercak-bercak mosaic pada bulunya. Bercak semacam itu menun¬jukkan pembentukan kion sel mutan yang bertanggung jawab ter¬hadap warna bulu. Uji ini relatif tidak mahal dan hanya mema¬kan waktu beberapa minggu. Meskipun dapat memberi hasil posi¬tif palsu, uji ini belum pemah memberi hasil negatif palsu. Kare¬nanya uji bercak itu merupakan alat pra-saring yang berguna un¬tuk mendeteksi mutasi germinal turunan pada mamalia (Russell, 1978).

PERUBAHAN KROMOSOM
Efek suatu toksikan pada kromosom dapat muncul sebagai aberasi struktural atau sebagai perubahan dalam jumlahnya. Efek yang pertama mencakup delesi, duplikasi, dan translokasi. Efek yang belakangan melibatkan pengurangan atau peningkatan jum¬lah kromosom. Beberapa efek itu diwariskan.
Cara kerja yang mendasari efek ini dapat melibatkan tautan silang (cross linkage) molekul, yang dapat menyebabkan terham¬batnya sintesis DNA, sehingga menyebabkan terbentuknya celah pada kromosom. Perbaikan yang tidak sempurna terhadap keru¬sakan DNA dapat juga menspakan penyebabnya. Nondisjunksi (gagalnya pemisahan sepasang kromosom selama pembelahan mitosis) dapat mengakibatkan mosaikisme. Suatu nondisjunksi selama gametogenesis (nondisjunksi meiosis) menyebabkan sel anak berisi satu kromosom ekstra atau berkurang satu kromoson dibandingkan keadaan normal. Yang pertama dikenal sebagai tri¬somi dan yang belakangan monosomi. Sejumlah sistem uji telah dikembangkan untuk menentukan efek kromosom. Berikut ini ada¬lah sistem-sistem yang utama.

Serangga
Drosophila melanogaster mempunyai keuntungan karena beberapa selnya memiliki kromosom yang bentuk dan ukurannya besar. Selain itu, berbagai efek kromosom dapat dengan mudah dipas¬tikan secara genetik, misalnya letalitas terangkai-seks resesif. Efek kromosom ini antara lain berupa hilangnya kromosom X dan Y, dan translokasi fragmen antara kromosom kedua dan ketiga.
Efek pada kromosom seks dapat juga dideteksi oleh peru¬bahan fenotipe, misalnya, warna badan dan warna serta bentuk mata (National Research Council, 1983).

Penelitian Sitogenetik dengan Sel Mamalia
Uji In Vitro Untuk uji sitogenetik, sel yang biasa diguna¬kan diperoleh dari limfoma mencit, ovarium tupai Cina, dan limfosit manusia. Sel-sel ini dibiakkan dalam perbenihan yang sesuai. Sel-sel itu kemudian dikenai zat kimia yang diuji dengan kadar yang berbeda-beda dengan atau tanpa sistem bioaktivator (biasanya fraksi mikrosorn dari homogenat hati tikus). Uji bia¬sanya dilakukan dengan dua mutagen kontrol positif, yaitu etil metan sulfonat yang bekerja langsung, dan dimetilnitrosamin yang membutuhkan bioaktivasi. Setelah suatu masa inkubasi yang sesuai, pembeiahan set dihambat oleh penambahan kolkisin. Sel kemu¬dian diambil, diwarnai, dan diberi skor (Cohen dan Hirshhorn, 1971).
Contoh cara memberi skor pada aberasi diperlihatkan di bawah ini: celah kromatid, patahan kromatid, celah kromosom, delesi kromatid. fragmen, fragmen asentrik, translokasi, triradial, kuad¬riradial, satu kromosom hancur, banyak krornosom hancur, set hancur, kromosom melingkar, kromosom disentrik, kromosom ke¬cil, lebih besar dari 10 aberasi, polipoid, dan hiperploid. Menge¬nai definisi berbagai istilah ini, lihat Brusick (1987).
Uji In Vivo Sel mamalia yang digunakan dalam penelitian efek kromosorn in vivo antara lain adalah sel germinal dan ja¬ringan somatik. Bahan kimia yang akan diuji diberikan kepada hewan utuh, misalnya hewan pengerat (mencit, tikus, tupai) dan manusia. Jaringan somatik yang biasa digunakan adalah sumsum tulang dan limfosit perifer. Protokal klasik yang menggunakan sumsum tulang mencit, tikus, atau tupai telah disediakan oleh Komite Ad Hoc dari Environmental Mutagen Society dan Insti¬tute for Medical Research (1972). Cara pemberian skor sama de¬ngan cara dalam uji in vitro.
Suatu prosedur in vivo yang agak lebih sederhana adalah uji mikronukleus. Ini dilakukan dengan menggunakan sel stem eritro¬sit polikromatik dari mencit CD-l. Enam jam setelah dua kali pemberian zat kimia yang diuji, dengan selang waktu 24 jam, hewan dibunuh dan sumsum tulang dikumpulkan dari kedua femur. Peningkatan jumlah set yang bermikronukleus dibanding¬kan kontrol (sekitar 0,5 %) dianggap positif (Schmid, 1976). Mikronukleus ini mewakili fragmen kromosom dan kromatid aki¬bat gangguan fungsi spindelfsentromer.
Untuk uji pada sel germinal, biasanya digunakan hewan jan¬tan. Untuk memungkinkan terpajannya set dengan berbagai tahap spermatogenesis yang berbeda, zat kimia diberikan setiap hari selama 5 hari dan hewan dikorbankan 1, 3, dan 5 minggu setelah dosis terakhir. Sperma dikumpulkan dengan membedah caudae epididimis. Setelah direkatkan dan diwarnai, dihitung insidens sperma dengan kepala yang abnormal, dan ini dibandingkan dengan kontrol negatif dan positif (Wyrobek dan Bruce, 1975).

Uji Letal Dominan pada Hewan Pengerat
Uji ini dirancang untuk menunjukkan efek toksik pada sel ger¬minal pada hewan jantan utuh, biasanya mencit atau tikus. Efek¬nya dapat muncul pada hewan betina yang dikawini dalam ben¬tuk matinya implantasi dan/atau hilangnya praimplantasi (beda antara jumlah korpus luteum dan jumlah implantasi). Efek ini biasanya disebabkan oleh kerusakan kromosom, yang meng¬akibatkan kesalahan perkembangan yang fatal bagi zigot. Na¬mun, efek sitotoksik lain dapat juga menyebabkan kematian di¬ni janin. Protokol khusus telah disediakan dalam sejumlah ma¬kalah (Ehling dkk., 1978).

Uji Translokasi Turunan pada Mencit
Pengujian ini dimaksudkan untuk mendeteksi kemampuan mewa¬riskan kerusakan kromosom. Kerusakan, yang terdiri atas translokasi timbal-balik dalam sel-sel germinal mencit jantan yang menda¬pat perlakuan, diteruskan kepada keturunannya. Dengan menga¬winkan keturunan jantan F1 dengan mencit betina yang tidak di¬beri perlakuan, efek kromosom terungkap dengan berkurangnya janin yang dapat hidup. Adanya translokasi timbal-balik ini dapat dibuktikan dengan kehadiran gambar translokasi di antara tetrad ganda selama meiosis (Adler, 1980).

PERBAIKAN DNA DAN REKOMBINASI
Proses biologik ini bukanlah mutasi, tetapi terjadi setelah keru¬sakan DNA. Karena itu fenomena ini menunjukkan adanya keru¬sakan DNA yang umumnya disebabkan oleh mutagen.

Bakteri
Di antara E. coli, ada bakteri yang memiliki enzim DNA poli¬merase I yang mampu memperbaiki kerusakan DNA, dan ada bakteri yang tak punya enzim ini. Mutagen menginduksi kerusakan DNA dan karenanya mengganggu pertumbuhan. E. coli yang kekurangan enzim perbaikan, sementara pertumbuhan bakteri yang memiliki enzim ini tidak dipengaruhi. Strain dengan perbaikan DNA yang efisien diikutsertakan untuk menyingkirkan efek sito¬toksisitas (Rosenkranz dkk., 1976).
Demikian juga, ada strain Basil subtilis yang mampu atau ti¬dak mampu mengalami rekombinasi. Pada strain yang pertama, kerusakan DNA dapat diperbaiki melalui rekombinasi, tetapi strain yang belakangan tidak dapat melakukannya. Dengan demikian mu¬tagen akan menghambat pertumbuhan strain yang kedua tetapi ti¬dak menghambat strain yang pertama (Kada dkk., 1972)

Ragi
Berbagai mikroorganisme eukariotik, misalnya, Saccharomyces ce¬revisiae, telah digunakan untuk menguji mutagenisitas zat kimia dengan pindah silang (crossing over) mitosis yang diinduksikan¬nya, konversi gen pada mitosis, dan mutasi balik yang diinduk¬sikannya.

Sel Mamalia
Sintesis DNA yang tidak terjadwal, suatu indikasi adanya per¬baikan DNA, dapat dideteksi pada sel manusia dalam biakan. Sintesis ini ditentukan oleh jumlah timidin radioaktif yang di¬ambil per unit berat DNA dibandingkan nilai kontrol. Ini diker¬jakan dengan atau tanpa sistem aktivator tambahan (Stich dan Laishes, 1973).
Sintesis semacam itu dapat juga ditentukan dalam sel pri¬mer hati tikus. Tingkat sintesis DNA ditentukan dengan meng¬gunakan metode autoradiografik. Karena sel-sel ini mempunyai aktivitas metabolik yang mencukupi, tidak perlu menambahkan sistem aktivator (Williams, 1977).

Pertukaran Kromatid Saudara
Uji ini mengukur pertukaran timbal-balik DNA antara dua kro¬matid saudara pada kromosom yang sedang membelah. Pertukaran terjadi karena adanya patahan dan penggabungan kembali DNA selama replikasinya. Uji ini dapat dikerjakan dengan mengguna¬kan sel limfoma mencit, sel indung telur tupai Cina, dan limfo¬sit manusia. Pada dasarnya uji ini dilakukan dengan memberi label sel dengan 5-BrdU (5-bromodeoksiuridin). Setelah dua sik¬lus replikasi, sel diwarnai dengan teknik Giemsa-plus-fluoresens. Frekuensi pertukaran kromatid saudara per sel dan per kromo¬som diberi skor dan dibandingkan. Pertukaran itu kelihatan ka¬rena dalam satu kromatid replikasi DNA yang semikonservatif menghasilkan penggantian BrdU pada satu untai polinukleotid, dan dalam kromatid lain BrdU diganti pada kedua untai, polinukleotid (Wolff, 1977).

UJI LAIN
Seperti dicatat dalam Bab 7, sejumlah uji yang berkaitan diguna¬kan untuk menentukan karsinogenisitas.

Transformasi Sel Mamalia in Vitro
Dalam uji ini biasanya, digunakan sel mencit BALB/3T3. Sel lainnya adalah sel embrio tupai Suriah, sel mencit l0Tl/2, dan sel manusia. Biasanya sel-sel ini akan tumbuh dalam perbenih¬an biakan membentuk suatu lapisan tunggal. Meskipun demikian, sel yang diberi karsinogen akan berbiak tanpa melekat pada per¬mukaan yang padat dan tumbuh di atas lapisan tunggal itu. Koloni yang memiliki banyak lapisan itu menunjukkan transformasi ganas: Titik akhir ini dapat dipastikan dengan menginjeksikan sel ini ke dalam hewan singenik. Umumnya, kalau sel telah menja¬lani transformasi, tumor ganas akan muncul (Kakunaga, 1973). Karena itu, hasil positif pada uji ini sangat bermakna.

Uji Pembesaran Inti
Sel HeLa ditanam dalam perbenihan biakan dan diberi zat ki¬mia yang diuji dengan kadar yang berbeda-beda. Setelah selang waktu tertentu, sel dipanen dan dihitung. Sel-sel itu kemudian dibuang zat sitoplasmanya dan ukuran intinya ditentukan dengan penghitung partikel. Membesarnya ukuran inti menunjukkan kar¬sinogenisitas zat kimia itu (Finch dkk., 1980).

EVALUASI
Kebutuhan akan Penelitian Mutagenesis
Bahaya mutagenesis tidak diragukan lagi. Seperti disebutkan sebe¬lumnya, banyak penyakit bawaan diduga berkaitan dengan aberasi kromosom serta mutasi gen dominan dan resesif. Selain itu, muta¬genesis dapat berguna pada penelitian etiologi penyakit biasa, mi¬salnya diabetes mellitus, epilepsi, skizofrenia, hipertensi esensial, katarak, penuaan, penyakit jantung, dan kanker tertentu. Akhirnya, harus diingat adanya hubungan erat antara mutagen dan karsino¬gen.
Dengan demikian, ada tantangan besar bagi ahli toksikologi untuk mengidentifikasi mutagen yang mengenai manusia dan menghitung risikonya. Sejauh ini, keberhasilan dalam daerah ini masih terbatas. Sistem uji baru masih dikembangkan, dan kesa¬hihan serta keterbatasan uji yang ada masih dipelajari. Namun, pengetahuan dalam bidang ini kini memberikan suatu dasar un¬tuk pendekatan rasional dalam menyaring toksikan dari segi po¬tensi mutagen/karsinogennya.

Pemilihan Sistem Uji
Karena mempengaruhi zat genetik dengan cara yang berbeda-be¬da, mutagen dapat memberi hasil negatif pada satu uji dan positif pada uji lainnya. Untuk menyingkirkan hasil negatif palsu (dan positif palsu), sebaiknya dilakukan beberapa uji, lebih baik uji dari kategori berbeda. OECD (1987) menganjurkan serangkaian uji untuk penyaringan, pemastian, dan penilaian risiko (Tabel 8¬2).
Komite Mutagen Kimia Lingkungan dari National Research Council menganjurkan suatu program penilaian mutagen (Natio¬nal Research Council, 1983). Disarankan bahwa uji mutagenesis ditempatkan dalam tiga tingkatan. Deretan tingkat I terdiri atas (1) Uji Salmonella/mutasi-gen mikrosom, (2) uji mutasi-gen sel
Tabel 8-2 Kegunaan dan Penerapan Esai
A. Esai yang dapat digunakan untuk penyaringan mutagen dan karsinogen
Esai mutasi balik Salmonella typhimurium
Esai mutasi balik Escherichia coli
Mutasi gen pada sel mamalia dalam biakan
Mutasi gen dalam Saccharomyces cerevisiae
Esai sitogenetik in vitro
Sintesis DNA tidak terjadwal in vitro
Esai pertukaran kromatid saudara in vitro
Rekombinasi mitosis dalam Saccharomyces cerevisiae
Esai sitogenetik in vivo
Uji mikronukleus
Uji letal terangkai-seks resesif pada Drosophila
B. Esai yang memastikan aktivitas in vitro
Esai sitogenetik in vivo
Uji mikronukleus
Uji bercak mencit.
Uji letal terangkai-seks resesif pada Drosophila
C. Essai untuk menilai efek pada sel germinal dan yang dapat dipakai untuk
memperkirakan risiko genetik
Esai letal dominan
Esai translokasi turunan
Esai sitogenetik sel germinal mamalia
Sumber: OECD, 1987.

mamalia, dan (3) uji patah kromosom set mamalia. Kalau semua uji itu negatif, zat kimia diduga nonmutagen bagi mamalia. Ka¬lau dua dari uji ini positif, zat ini digolongkan sebagai "diduga mutagen bagi mamalia". Kalau hanya satu yang positif, perlu di¬lakukan uji deretan II (mutasi letal terangkai-seks pada Droso¬phila). Untuk lebih jauh menyaring zat-zat kimia yang penting, dilakukan uji tambahan. Uji lokus-khusus dianjurkan untuk zat kimia yang mempunyai potensi mutagenisitas pada set germinal mamalia, dan uji letal dominan harus dilakukan untuk zat kimia yang menunjukkan berbagai efek kromosom.

Kemaknaan Hasil
Hubungan antara Mutagenisitas dan Karsinogenisitas
Beberapa penyelidik telah memperlihatkan hubungan antara karsinogen dan mutagen. Contohnya, McCann dkk. (1975) melaporkan penelitian mereka rnengenai mutagenisitas 300 zat kimia dengan uji Salmonella/mikrosom. Hasilnya dibandingkan dengan laporan karsinogenisitas atau nonkarsinogenisitas zat-zat ini. Dengan uji itu mereka mensnjukkan korelasi yang tinggi antara kedua efek toksik itu: 90% (156/175) karsinogen juga bersifat mutagen. Ha¬nya sedikit zat nonkarsinogen yang memperlihatkan sifat muta¬genisitas.
Dari 18 karsinogen yang rnemberi hasil negatif-palsu, bebe¬rapa terbukti membutuhkan aktivasi metabolik lain (contohnya, sikasin dan 1,2 dimetilhidrazin tidak bersifat karsinogen pada he¬wan bebas-kurnan, menunjukkan adanya kebutuhan akan aktivasi oleh flora usus ). Karsinogen lainnya, misalnya aminotriazol, tio setamid, dan tiourea bersifat goitrogen dan menyebabkan tumor tiroid lewat mekanisme non-mutagen (lihat juga Bab 7). Lainnya, misalnya anrarnin, bersifat karsinogen hanya karena pengotornya. Mutagenisitas dietilstilbestrol tidak dapat diuji sebagaimana knes¬tinya dalam sistLm ini karena toksisitasnya pada bakteri itu.
Baru-baru ini, Mason dkk. (1989) rnenghimpun informasi raengenai hubungan antara karsinogenisitas pada hewan pengerat dan mutagenisitas yang ditentukan oleh S. ryphim.urium. Korelasi ini bervariasi antara 55 dan 93%.
Efek Turunan Pada waktu ini tidak ada korelasi langsung antara uji laboratorium untuk mutasi turunan dan pengalaman manusia. Namun, kalau suatu zat telah terbukti dapat bersifat mutagen dalam berbagai jenis sistem uji termasuk mutasi turun¬an pada mamalia utuh, zat itu harus dianggap suatu mutagen manusia kecuali kalau ada bukti sebaliknya. Selain itu, bagi ba¬nyak zat kimia, misalnya zat tambahan makanan, pestisida, kos¬metik, dan sebagian besar obat yang pajanannya dapat dihindari, informasi yang sangat sedikit cukup sebagai alasan untuk penun¬daan penggunaannya (lihat Flamm, 1977). Pada masa kini belum ada metode tepercaya yang tersedia untuk memperkirakan risiko akibat mutagen berdasarkan kekuatannya (National Research Coun¬cil, 1983).
Seperti telah disebut di atas, penyelidikan tentang mutage¬nesis adalah suatu disiplin baru. Pengetahuan yang dengan cepat diperoleh dalam bidang ini mungkin sekali akan mempengaruhi tafsiran mengenai pentingnya hasil suatu pengujian mutagensi¬tas di samping mempengaruhi seleksi sistem uji untuk menyaring berbagai toksikan.